Γράφει η Άννα Λυμπεροπούλου
Μοριακή Βιολόγος, Συνεργάτης του δικτύου Iatrica

Η μοριακή διαγνωστική είναι μια συλλογή τεχνικών που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση βιοδεικτών στο γονιδίωμα και το πρωτέωμα, στον γενετικό κώδικα δηλαδή του κάθε ατόμου όπου αυτός εκφράζει τα γονίδια σε πρωτεΐνες, εφαρμόζοντας τη μοριακή βιολογία σε ιατρικές εξετάσεις. Οι μοριακές αυτές τεχνικές χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση και την  παρακολούθηση ασθενειών, την πρόγνωσή τους αλλά και τη θεραπευτική προσέγγιση για το ποιες δηλαδή θεραπείες θα λειτουργούν καλύτερα σε μεμονωμένους ασθενείς. 

Ο τομέας της μοριακής βιολογίας αναπτύχθηκε στα τέλη του εικοστού αιώνα, όπως και η κλινική του εφαρμογή, καθώς και η ορολογία μοριακή διαγνωστική χρησιμοποήθηκε σε διάφορες νεοσύσατατες ιατρικές εταιρίες στη δεκαετία του 80. Το 1980, οι Yuet Wai Kan et al. πρότεινε ένα προγεννητικό τεστ για τη θαλασσαιμία που δε βασίστηκε σε αλληλούχιση του DNA, που τότε βέβαια ήταν σε εμβρυϊκά στάδια, αλλά σε μία συντομότερη μοριακή τεχνική αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης την RFLP (restriction fragment length polymorphism) η οποία αποκαλύπτει το πρότυπο θραυσμάτων περιορισμού μιας αλληλουχίας. Το πρότυπο αυτό διαφέρει σε άτομα που φέρουν μια συγκεκριμένη μετάλλαξη θαλασσαιμίας και άρα με την τεχνική αυτή κατηγοριοποιούνται άτομα φορείς της μετάλλαξης σε σχέση με αυτούς που δε διαθέτουν τη μετάλλαξη και άρα εμφανίζουν διαφορετικό πρότυπο. Η RFLP χρησιμοποιείται σήμερα για την ανίχνευση ποικίλων πολυμορφισμών-μεταλλάξεων όπως μεταλλάξεις σχετιζόμενες με την κυστική ίνωση, με τη θρομβοφιλία, με τη συνδρομική αμφοτερόπλευρη κώφωση κ.α.  Γενικά, η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR (polymerase chain reaction) στην οποία βασίζεται και η RFLP, είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μοριακή τεχνική. Eίναι μία τεχνική, που επωφελείται της ευκολίας παραγωγής συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων για τον in vitro πολλαπλασιασμό περιοχών DNA για τις οποίες έχουμε κάποια γνωστή αλληλουχία. Συνίσταται από  επαναληπτικούς κύκλους αντιγραφής DNA, αρχίζοντας από μία μήτρα DNA και δύο συνθετικούς εκκινητές που συνθέτουν προς την αντίθετη κατεύθυνση, ο ένας προς τον άλλο (εικόνα 1). Σε κάθε κύκλο η ποσότητα του DNA ανάμεσα από τους δύο εκκινητές διπλασιάζεται. Mπορούμε έτσι επιλεκτικά να πολλαπλασιάσουμε μία μικρή περιοχή από ένα πολύπλοκο δείγμα DNA. H PCR πραγματοποιείται σε κυκλικά προγραμματιζόμενους θερμοεπωαστές (thermal cyclers or PCR machines) και μας δίνει τη δυνατότητα πολλαπλασιασμού του DNA σε πολύ ψηλά επίπεδα (x106), επιτυγχάνοντας έτσι τη μελέτη DNA αλληλουχιών από πολύ μικρά δείγματα (πολλές φορές μέχρι και ένα κύτταρο).

Το τελευταίο διάστημα η PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR) έχει μονοπωλήσει το ενδιαφέρον του πλανήτη, καθώς είναι η μοριακή αυτή τεχνική που ως επι το πλείστων επιλέγεται για την ανίχνευση του νέου κορονοϊού SARS-COV-2. Αποτελεί μέθοδο αυξημένης ευαισθησίας και ειδικότητας ανιχνεύοντας >10 αντίγραφα ιϊκού γενετικού υλικού, γιαυτό άλλωστε είναι καταλληλότερη για τη διάγνωση των λοιμώξεων που χαρακτηρίζονται από  μικρό μικροβιακό φορτίο πχ. Μηνιγγίτιδα ή για μικροοργανισμούς που ανιχνεύονται δύσκολα με τις υπάρχουσες τεχνικές όπως μυκοβακτηρίδια, αναερόβιοι κ.α. Τα χλαμύδια (Chlamydia trachomatis) και η γονόρροια (Neisseria gonorrhoeae) αποτελούν επίσης σεξουαλικώς μεταδιδόμενα μικρόβια που ανιχνεύονται αποτελεσματικότερα με την PCR. Άλλο ένα πλεονέκτημα συνεπώς της μεθόδου είναι η έγκαιρη διάγνωση των λοιμώξεων πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων δίνοντας ευκαιρία στην έγκαιρη θεραπεία. Η ανίχνευση μικροοργανισμών και μετά την έναρξη θεραπείας δίνει τη δυνατότητα παρακολούθησης μιας παθολογικής κατάστασης  όπως για παράδειγμα την παρακολούθηση του HIV μετά από τη λήψη θεραπείας. Στόχος της θεραπείας στην λοίμωξη αυτή είναι το όσο το δυνατόν λιγότερο ιϊκό φορτίο στον οργανισμό όπου μια μέθοδος που να ανιχνεύει μικρό ποσοστό ιϊκού φορτίου κρίνεται απαραίτητη. Θα πρέπει στο σημείο αυτό να τονιστεί η σημασία της PCR στην ανίχνευση και ταυτοποίηση του HPV και των υποτύπων του. Η επιτυχής θεραπευτική προσέγγιση σχετικά με την αντιμετώπιση του καρκίνου του τραχήλου αποδίδεται σε μεγάλο ποσοστό στην τεχνική ταυτοποίησης του υποτύπου/ων που υπάρχουν στις κυτταρικές τραχηλικές αλλοιώσεις σε κάθε γυναίκα: υπάρχουν υποτύποι HPV που σχετίζονται με αυξημένη επιθετικότητα και αύξηση της πιθανότητας εμφάνισης καρκινικών εξαλλαγών. Έτσι δίνεται η επιλογή στον ιατρό να επιλέξει θεραπευτική αντιμετώπιση, περισσότερο ή λιγότερο επιθετική, ανάλογα με τον υποτύπο που ανιχνεύεται. 

Οι σύγχρονες μοριακές τεχνικές βασίζονται σημαντικά και στην αλληλούχιση του DNA νέας γενιάς NGS (Next Generation Sequencing). Η συγκεκριμένη μοριακή τεχνική είναι απαραίτητη στην περίπτωση που αναζητούνται μεταλλάξεις σε όλο το γονίδιο όπως για παράδειγμα στα γονίδια BRCA ½. Οι μεταλλάξεις υψηλού κινδύνου στα BRCA1 και 2 απενεργοποιούν μια αναντικατάστατη διαδικασία επιδιόρθωσης του DNA, οπότε αυξάνεται σημαντικά ο κίνδυνος να αναπτύξει ένα άτομο καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών. Οι μεταλλάξεις στο ΚRAS γονίδιο επίσης έχουν μεγάλη σημασία σε σχέση με την θεραπευτική επιλογή: άτομα με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο εξετάζονται για τις KRAS μεταλλάξεις. Έτσι τα αντι-EGFR φάρμακα Erbitux (cetuximab) και Vectibix (panitumumab) δε χορηγούνται σε ασθενείς με συγκεκριμένες KRAS μεταλλάξεις. Στοχευμένες μεταλλάξεις ανιχνευονται με PCR, real time PCR, RFLP PCR αλλά και με NGS για ανίχνευση μεταλλάξεων σε όλο το γονίδιο.  

Η μοριακή διαγνωστική βρίσκει τελικά ποικίλες εφαρμογές σε μια σειρά ιατρικών τομέων συμπεριλαμβανομένων των μολυσματικών ασθενειών, ανιχνεύοντας και τυποποιώντας εξωγενές γενετικό υλικό παθογόνων οργανισμών, με κύρια έμφαση στους ιούς και μικρόβια, της ογκολογίας και της φαρμακογονιδιωματικής (τη γενετική πρόβλεψη των φαρμάκων που θα λειτουργούν καλύτερα), ανιχνεύοντας την έκφραση ενδογενούς γενετικού υλικού, που σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις ή γενετικών μεταλλαγών -πολυμορφισμών ανθρώπινων γονιδίων, που σχετίζονται με την καρκινογένεση ή την κληρονομική προδιάθεση ασθενειών. Οι μοριακές τεχνικές είναι αυτές που ανοίγουν το δρόμο για την εξατομικευμένη ιατρική, το πεδίο δηλαδή που αφορά τη συσχέτιση γονιδίων με κληρονομικές νόσους, καθώς και την ανταπόκριση στην φαρμακευτική αγωγή.